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微生物检测基础知识及常见消毒灭菌方式汇总!(水分活度仪)

2018/03/05

微生物检测基础知识及常见消毒灭菌方式汇总!(水分活度仪

一、微生物的概念与分类

在自然界里,有许多肉眼不能直接看见,必须借助于显微镜放大才能观察到微小生物,这些微小生物总称为微生物。

微生物的分类,目前公认的包括七大类。即病毒立克次体支原体细菌放线菌螺旋体真菌(酵母菌、霉菌)。排在前面的小而低等,排在后面的逐渐大而高等,本文内容只重点介绍三类。

二、微生物的特点

微生物除了个体微小、结构简单这一基本特征以外,还有一些其他特点也是与众多生物不同的。

(一)种类繁多

微生物的数量和种类是十分惊人的。一滴水,一颗土粒往往都是一个微生物社会。其中以土壤内的生存密度最大,1克较肥活的土壤常含有几亿到几十亿个微生物;贫瘠土壤每克也含有几百万到几千万个,一只肮脏的苍蝇,全身能携带5亿多个细菌。

三对足能粘附700万至1000万个细菌,可见微生物的密集度之大。微生物的各类也很可观,自然界已知的微生物就有10万种左右。

(二)分布广泛

微生物是地球上分布最广泛的一类生物。在辽阔的自然界中,无论土壤、水域、空气以及动物、植物、人体内外都有大量微生物存在。有些微生物能够在异常的条件下生存,例如耐酸菌能在10%的硫酸溶液中生活,嗜热菌能在温度高达98℃以上的温泉中生活,有的甚至在高达200300℃的深海火山口附近也能活动,嗜盐菌在含盐量高达23%25%的死海里,甚至30%的摘录化钠溶液中和盐块上存活,显然这是一般生物所望尘莫及的。

(三)繁殖迅速

微生物的繁殖速度也是同样惊人的,比高等动植物快得多,有些细菌,在适宜条件下每20分钟就可以繁殖一次,例如大肠杆菌,1个细菌经20分钟就分裂成2个,每小时可分裂3次,这样,1个细菌繁殖3代就产生8个细菌。即:

 

1小时            =8

2小时            8×23=64

3小时            64×23=512

4小时            512×23=4096

24小时          1×272=4.7*1021

 

照此速度繁殖下去,24小时就可繁殖72代,数量大约为4.7*1021个。所以细菌培养24小时就可以看见菌群。其增殖速率是相当惊人的。但因种种条件(营养物质)限制,这种繁殖速度是不能持久的。尽管如此,微生物这种快速繁殖能力应用到工业发酵上,在短时间内得到大量增殖,收或较多的产物,也是有着重要意义的。

 

三、常见的微生物

(一)细菌

细菌是能够独立地进行生长繁殖的单细胞生物,种类很多,大小不一,平均约1.0μm,用显微镜放大1000倍,也只有1.0mm大小,所以肉眼看不见。

细菌的形态是不完全相同的,一般可归纳为三种类型:

1.球菌  单独存在时呈球形,按其分裂的方式和分裂后的排列,可分为单球菌、双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等,菌体直径约0.51.0μm

2.杆菌  菌体呈杆状或近似杆状。大小、长短、粗细很不一致,有的粗短近似球菌,称为球杆菌;有的杆菌一端膨大似棒状,称为棒状杆菌;有的排列成链状,称为链杆菌;有的生长成侧枝,称为分枝杆菌。大部分杆菌长约2.03.0μm,宽0.51.0μm,病原细菌中杆菌的种类最多。

3.弧菌和螺菌  菌体呈弯曲或螺旋状,只有一个弯曲,呈逗点状为弧菌,如霍乱弧菌;有数个弯曲较为坚韧的为螺菌,如鼠咬热螺菌。

(二)病毒

病毒是体积最小,结构最简单,没有细胞结构,而只能寄生在其它生物的细胞内,利用宿主细胞的酶系统和营养物质进行生长繁殖的原始生物。病毒的形态多数呈球形,少数呈杆状或砖块状,细菌病毒(噬菌体)多数呈蝌蚪状,平均大小只有0.1μm,比细菌约小10倍,最小的病毒只有0.01μm,接近蛋白质分子。病毒大多能通过滤菌器,故俗称滤过性病毒。

 猪流感病毒

(三)真菌

真菌是体积最大,结构比较复杂的微生物。真菌在自然界里广泛存在,如使衣物、食品发霉的霉菌,酿酒或发醇面粉的醇母菌都是真菌。病原真菌也较常见,如皮肤浅表的癣菌。真菌对热的抵抗力不强,60℃加热1小时即被杀死。真菌分单细胞真菌和多细胞真菌;单细胞真菌和多细胞真菌;单细胞真菌通称为酵母菌。多细胞真菌通称为霉菌。

四、细菌细胞的特殊结构

有的细菌除具有上述基本结构外,尚有某些特殊结构,如荚膜、芽胞、鞭毛、菌毛等。

1.荚膜 

有些细菌在一定的营养条件下,向细胞壁表面分泌一种粘液状物质,形成一层较厚的膜(约0.2μm)称为荚膜。荚膜中含有大量水分,荚膜对菌体有保护作用,可保护细菌抵抗干燥。细菌的荚膜与细菌的致病力有关,具有荚膜的细菌不易被白细胞所吞噬,故能在机体内生长繁殖,引起感染。

2.芽胞

某些细胞生长到一定时期或当外界条件改变时对细菌生长不利时,菌体内的细胞浆发生脱水浓缩,逐渐形成圆形或椭圆形的小体,位于菌体中央或末端,称为芽胞,如下图所示,芽胞是细菌的休眠体,一个繁殖体只能形成一个芽胞。芽胞外部有数层厚而致密的膜,可抵御外界不良的环境,对于高温、干燥、光线、化学药品等有抵抗力比繁殖体为强,没有形成芽胞的细菌,在70℃以上就逐渐死亡,而芽胞却能抵抗100℃或更高一些的温度。因此,杀死芽胞要比杀死细菌的繁殖体困难得多,有的芽胞存活多年而不丧失其活力,当遇到合适条件又可生长繁殖,因此灭菌的效果应以杀死芽胞为标准。

五、细菌的生长繁殖和代谢产物

1.细菌的繁殖方式

细菌的繁殖方式是简单无性二分裂法,即一个细菌分为二个,二个分为四个,如此继续下去。球菌由于沿着一个平面或几个平面,故呈链状、葡萄状、双球菌、四联球菌、八叠球菌等状态;杆菌一般沿横轴分裂。

大部分细菌的繁殖速度很快,如大肠杆菌在适宜的条件下,每20分钟就可繁殖一代,若保持此速度繁殖10小时后,一个细菌可以繁殖10亿个。细菌繁殖虽然如此迅速,但它是受各方面因素所制约,决不能无限制地繁殖下去。

2.生长繁殖的条件

1    细菌的生长繁殖是从外界吸收营养物质,通过本身含有的许多酶系统,进行一系列的生化反应分解转化成简单物质,然后加以吸收利用。水是细菌生活所不可缺水的物质。

2)碳和氮化合物、无机盐等  这些是细菌营养所必须的物质。

3)气体  氧、二氧化碳和氮与细菌的生长繁殖有密切的关系。有些细菌必须有充分的氧气供应才能生活,称为需氧菌,如结核杆菌;另一类则恰相反,要在缺氧的环境下才能生活,有氧存在反而对它们生长不利,称为厌氧菌,如破伤风杆菌;大多数但致病菌处于这两者之间,有氧无氧都生活的则称为兼性厌氧菌,如大肠杆菌。

4)酸碱度  大多数病原菌生长最适宜的酸碱度为pH7.27.6

5)温度  根据细菌对温度要求的不同,可分为嗜冷菌、嗜温菌及嗜热菌。一般病原菌的适宜温度基本与人类体温相同,因而实验室培养细菌均采用37℃。(霉菌25℃

3.代谢产物

细菌在生长繁殖中,可产生大量的代谢产物,有的分泌到菌体外面,有的包含在菌内,有一些代谢产物对人体有益,如抗生素、维生素等;但有一些代谢产物对人体是有害的,如热原等,这些产物一旦进入机体可以致病或使体温升高。

六、外界环境中对微生物生长的影响因素

1.温度和化学因素  温度和化学因素对微生物的生长繁殖影响极大,将在物理灭菌法和化学灭菌法中讲述。

2.pH  pH值对微生物生长的影响 ,中性繁殖最快。

3.湿度  温度可以促使细菌生长,特别对霉菌繁育更快。因此防止湿度过大对于避免染菌霉败有一定的作用。

水的活度对细菌生长的重要性,提高食品成分结合水分能力从而改变水活度。

4.渗透压  微生物的细胞具有半透膜的性质,可以透水,但对于其他物质的透过则有选择性,低渗药液可使细胞膜膨胀,但高透药液可使细胞内水分渗出而处于脱水状态。所以一般微生物在浓盐溶液或浓糖溶液中不易生长繁殖,就是由于细菌细胞内水分渗出而脱水的缘故。如蔗糖是微生物的良好营养;单糖浆含蔗糖85%,为其等渗浓度9.25%9倍多,却能保持不长菌;若浓度不够,容易长菌败坏。

七、有关名词解释

灭菌  系指杀死或除去所有微生物的繁殖体和芽胞,使之完全无菌。

消毒  系指仅仅杀灭病原微生物,使之不成为传染源。

杀菌  系指使用化学药品或物理因素,对微生物在短时间内起杀灭的作用。

抑菌  即抑制微生物繁殖体的生长及其繁殖。

防腐  系指防止或抑制微生物生长繁殖的方法。

无菌  系指没有任何活的微生物存在。

八、物理灭菌法

(一)加热灭菌法

加热可破坏微生物中酶、蛋白质和核酸,导致微生物死亡。加热灭菌又分干热灭菌法和湿热灭菌法。在同一温度下,湿热灭菌的效果比干热灭菌好。主要是因湿热灭菌时,有水分存在,蛋白质容易变性。水分又易使微生物膜壁润湿,湿热的穿透力比干热大。

干热灭菌法  常用的有火焰灭菌法与干热空气灭菌法两种。

(二)紫外线灭菌法

是指用紫外线照射杀灭微生物的方法。一般用于灭菌的紫外线波长是200~300nm,灭菌力最强的波长是253.7nm。紫外线作用于核酸蛋白促使其变性,同时空气受紫外线照射后产生微量臭氧,从而起共同杀菌作用。紫外线进行直线传播,可被不同的表面反射,穿透力微弱,但较易穿透清洁空气及纯净的水。因此本法适用于照射物体表面之灭菌、无菌室的空气及水的灭菌;不适用于药液的灭菌、固体物质深部的灭菌;普通玻璃可吸收紫外线,因此装于玻璃容器中的药物不能用此法灭菌。紫外线对人体照射过久,会发生结膜炎,红斑及皮肤烧灼等现象,故一般在人入室前开启紫外线灯1~2小时,关闭后人才进入洁净室。如果必须在人进去后仍要开紫外线灭菌,则人的皮肤及眼睛应有有效的防护措施。一般在6~15m3的空间可装置30瓦紫外线灯一盏,离地面2.5~3m为宜。

用紫外线照射灭菌时要注意下列问题:

1、紫外线的杀菌力,随使用时间增加而减退,一般使用时间达到额定时间70%时应更换紫外线灯管,以保证杀菌效果。国产紫外线灯平均寿命一般为2000h

2、紫外线的杀菌作用随菌种不同而不同,杀霉菌的照射量要比杀杆菌大40~50倍。

3、紫外线照射通常按相对湿度为60%的基础设计,室内湿度增加时,照射量应相应增加。

4、紫外线灭菌效果与照射的时间长短有关,这需要通过验证来确定照射时间。

5、紫外照射灯的安装形式及高度,应根据实际情况,参考使用说明决定。

灭菌方法的验证采用生物指示剂挑战试验,生物指示剂多用枯草芽孢杆菌。

(三)微波灭菌法

微波是指频率在30~3000MHz之间的电磁波。水可强烈地吸收微波,使其极性分子转动,分子间的磨擦而生热,且升温迅速,靠热力而灭菌。在数十秒至几分钟之内可达100150℃,并全部杀死液体中的微生物,适于水溶性注射液的灭菌。另外,固体药材饮片及固体制剂(丸剂、散剂、胶囊粉等)也含少量水分,微波能穿透到固体内部,由表至里被均匀加热,而起干燥、灭菌的作用。多用于口服液体制剂的灭菌,有望用于注射液的灭菌。但可能对某些药品的PH值、含量、颜色有影响。

(四)辐射灭菌法

辐射灭菌是应用γ射线、β射线杀灭细菌的方法,又称电离辐射,前者由钴-60或铯-137发出,穿透力强;后者由电子加速器产生,带电荷,穿透力弱,灭菌效果差。

九、化学灭菌法

化学灭菌法系指用化学药品来杀灭微生物的方法。同一种化学药品的低浓度时呈现抑菌作用,而在高浓度时则能起杀菌作用。其杀菌机理可能是:能使微生物蛋白质变性死亡,或与酶系统结合影响代谢,或改变膜壁通透性使微生物死亡等。常用的方法有消毒剂消毒法和化学气体灭菌法等。

(一)消毒剂消毒法

消毒是指杀死病原微生物的方法。但化学消毒剂大多仅能杀死微生物的繁殖体而不能杀死芽孢,能控制一定范围的无菌状态。可将消毒剂配成适宜浓度,采用喷淋、涂擦或浸泡等方法对物料、环境、器具等进行消毒。常用的化学消毒剂有0.1%0.2%苯扎溴铵溶液、3%5%的酚或煤酚皂溶液、75%乙醇等。常用于物体表面灭菌。但要注意其浓度不要过高,以防止化学腐蚀作用。洁净室的墙面、天花板、门窗、机器设备、仪器、操作台、车、桌、椅等表面以及人体双手(手套)在环境验证及日常生产时,应定期清洁并用消毒剂喷洒,无菌室用的消毒剂必须在层流工作台中,用0.22μm的滤膜过滤后方能使用。

(二)化学气体灭菌法

系指利用化学药品的气体或产生的蒸汽进行杀灭微生物的方法。

1.环氧乙烷灭菌法 

环氧乙烷灭菌法是利用环氧乙烷气体进行杀菌的方法。它是一种传统的灭菌方法,可应用于工衣灭菌、不耐加热灭菌的药品、医用器具、设施、设备等的灭菌。

环氧乙烷灭菌系统,主要有下列四项互相制约的重要因素影响灭菌效果:

1、温度;2、湿度;3、气体浓度;4、灭菌时间。

因为环氧乙烷是易燃易爆物质,明火可以引起燃烧,同时由于气体分解还可能引起爆炸,环氧乙烷灭菌中应十分注意安全问题。

2.甲醛等蒸汽熏蒸法 

采用甲醛、丙二醇或过氧醋酸等化学品,通过加热产生蒸汽进行空气环境灭菌。

(1)、计算房间体积,按10g/m3的比例称出甲醛。

(2)、将甲醛倒入甲醛发生器或加热盘或烧杯中,并放好加湿用水,必要时还需加入高锰酸钾(2~3g/m3),然后加热(甲醛发生器用蒸汽加热,加热盘或烧杯用热水盛入其中加热)使其蒸发成气体。

(3)、灭菌流程:空调器停止运转启动甲醛气体发生器或在加热盘中加热甲醛  →让甲醛气体扩散约30分钟启动空调器让甲醛气体循环约30分钟停止空调器,房间熏蒸消毒,时间不少于8小时房间排气,用新鲜空气置换约2小时恢复正常运行。

当相对湿度在65%以上,温度在24~40℃时,甲醛气体的消毒效果最好。

3、臭氧消毒法

臭氧(O3)的消毒原理是:臭氧在常温、常压下分子结构不稳定,很快自行分解成氧(O2)和单个氧原子(O),后者具有很强的活性,对细菌有极强的氧化作用,臭氧氧化分解了细菌内部氧化葡萄糖所必须的酶,从而破坏其细胞膜,将其杀死。多余的氧原子则会自行重新结合成为普遍氧分子(O2),不存在任何有害残留物,故称为无污染消毒剂。它不但对种种细菌(包括肝炎病毒、大肠杆菌、绿脓杆菌及杂菌等)有极强的杀灭能力,而且对霉菌也很有效。

十、无菌操作法

无菌操作室应达到GMP的规定,为达无菌的要求可采取综合措施:

应采用层流洁净空气技术;

可采用甲醛等蒸汽熏蒸法消毒和紫外灯灭菌法进行空气环境灭菌;

室内用具、墙、桌等暴露面用消毒剂喷、擦消毒;

其他物品可热压或干热法灭菌;

操作人员衣、帽、鞋、手等消毒及灭菌。

无菌操作室应定期进行菌落检查。一般采用培养皿暴露20~30min37℃培养48h,每只培养皿内不超过3个菌落为合格。

十一、食品的防腐与防腐剂

微生物有水分及其他适宜条件就可以繁殖,很多食品易被微生物污染,所以除采用适当方式灭菌外,可加防腐剂以抑、杀微生物。

防腐剂,又称抑菌剂,系指能抑制微生物生长繁殖的物质,常用的防腐剂有:

1.苯甲酸与苯甲酸钠  为常用的有效防腐剂,一般用量为0.1%.25%。苯甲酸水溶性较差,而苯甲酸钠水溶性好,易溶解,应用方便。

2.对羟基苯甲酸酯(尼泊金类)  有甲、乙、丙、丁四种酯,抑霉菌作用较强,一般用量为0.01%0.25%

3.山梨酸与山梨酸钾  山梨酸的分子结构式为CH3—CH=CH—CH=CH—COOH,常用浓度为0.15%0.05%。对细菌和霉菌均有较强抑菌效力。

 4.其他  20%以上乙醇、含30%以上的甘油、中药中很多挥发油及0.1脱水醋酸等均有防腐效力。

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