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微生物检测基础知识及常见消毒灭菌方式

一、微生物的概念与分类

在自然界里，有许多肉眼不能直接看见，必须借助于显微镜放大才能观察到微小生物，这些微小生物总称为微生物。

微生物的分类，目前公认的包括七大类。即病毒→立克次体→支原体→细菌→放线菌→螺旋体→真菌（酵母菌、霉菌）。排在前面的小而低等，排在后面的逐渐大而高等，本文内容只重点介绍三类。

二、微生物的特点

微生物除了个体微小、结构简单这一基本特征以外，还有一些其他特点也是与众多生物不同的。

（一）种类繁多

微生物的数量和种类是十分惊人的。一滴水，一颗土粒往往都是一个微生物“社会”。其中以土壤内的生存密度很大，1克较肥活的土壤常含有几亿到几十亿个微生物；贫瘠土壤每克也含有几百万到几千万个，一只肮脏的苍蝇，全身能携带5亿多个细菌。

三对足能粘附700万至1000万个细菌，可见微生物的密集度之大。微生物的各类也很可观，自然界已知的微生物就有10万种左右。

（二）分布广泛

微生物是地球上分布很广泛的一类生物。在辽阔的自然界中，无论土壤、水域、空气以及动物、植物、人体内外都有大量微生物存在。有些微生物能够在异常的条件下生存，例如耐酸菌能在10%的硫酸溶液中生活，嗜热菌能在温度高达98℃以上的温泉中生活，有的甚至在高达200～300℃的深海火山口附近也能活动，嗜盐菌在含盐量高达23%～25%的死海里，甚至30%的摘录化钠溶液中和盐块上存活，显然这是一般生物所望尘莫及的。

（三）繁殖迅速

微生物的繁殖速度也是同样惊人的，比高等动植物快得多，有些细菌，在适宜条件下每20分钟就可以繁殖一次，例如大肠杆菌，1个细菌经20分钟就分裂成2个，每小时可分裂3次，这样，1个细菌繁殖3代就产生8个细菌。即：

1小时            =8个

2小时            8×23=64个

3小时            64×23=512个

4小时            512×23=4096个

24小时          1×272=4.7*1021

照此速度繁殖下去，24小时就可繁殖72代，数量大约为4.7*1021个。所以细菌培养24小时就可以看见菌群。其增殖速率是相当惊人的。但因种种条件（营养物质）限制，这种繁殖速度是不能持久的。尽管如此，微生物这种快速繁殖能力应用到工业发酵上，在短时间内得到大量增殖，收或较多的产物，也是有着重要意义的。

三、常见的微生物

（一）细菌

细菌是能够独立地进行生长繁殖的单细胞生物，种类很多，大小不一，平均约1.0μm，用显微镜放大1000倍，也只有1.0mm大小，所以肉眼看不见。

细菌的形态是不完全相同的，一般可归纳为三种类型：

1.球菌  单独存在时呈球形，按其分裂的方式和分裂后的排列，可分为单球菌、双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等，菌体直径约0.5～1.0μm。

2.杆菌  菌体呈杆状或近似杆状。大小、长短、粗细很不一致，有的粗短近似球菌，称为球杆菌；有的杆菌一端膨大似棒状，称为棒状杆菌；有的排列成链状，称为链杆菌；有的生长成侧枝，称为分枝杆菌。大部分杆菌长约2.0～3.0μm，宽0.5～1.0μm，病原细菌中杆菌的种类很多。

3.弧菌和螺菌  菌体呈弯曲或螺旋状，只有一个弯曲，呈逗点状为弧菌，如霍乱弧菌；有数个弯曲较为坚韧的为螺菌，如鼠咬热螺菌。

（二）病毒

病毒是体积很小，结构很简单，没有细胞结构，而只能寄生在其它生物的细胞内，利用宿主细胞的酶系统和营养物质进行生长繁殖的原始生物。病毒的形态多数呈球形，少数呈杆状或砖块状，细菌病毒（噬菌体）多数呈蝌蚪状，平均大小只有0.1μm，比细菌约小10倍，小的病毒只有0.01μm，接近蛋白质分子。病毒大多能通过滤菌器，故俗称滤过性病毒。

 猪流感病毒

（三）真菌

真菌是体积较大，结构比较复杂的微生物。真菌在自然界里广泛存在，如使衣物、食品发霉的霉菌，酿酒或发醇面粉的醇母菌都是真菌。病原真菌也较常见，如皮肤浅表的癣菌。真菌对热的抵抗力不强，60℃加热1小时即被杀死。真菌分单细胞真菌和多细胞真菌；单细胞真菌和多细胞真菌；单细胞真菌通称为酵母菌。多细胞真菌通称为霉菌。

四、细菌细胞的特殊结构

有的细菌除具有上述基本结构外，尚有某些特殊结构，如荚膜、芽胞、鞭毛、菌毛等。

1.荚膜 

有些细菌在一定的营养条件下，向细胞壁表面分泌一种粘液状物质，形成一层较厚的膜（约0.2μm）称为荚膜。荚膜中含有大量水分，荚膜对菌体有保护作用，可保护细菌抵抗干燥。细菌的荚膜与细菌的致病力有关，具有荚膜的细菌不易被白细胞所吞噬，故能在机体内生长繁殖，引起感染。

2.芽胞

某些细胞生长到一定时期或当外界条件改变时对细菌生长不利时，菌体内的细胞浆发生脱水浓缩，逐渐形成圆形或椭圆形的小体，位于菌体中央或末端，称为芽胞，如下图所示，芽胞是细菌的休眠体，一个繁殖体只能形成一个芽胞。芽胞外部有数层厚而致密的膜，可抵御外界不良的环境，对于高温、干燥、光线、化学药品等有抵抗力比繁殖体为强，没有形成芽胞的细菌，在70℃以上就逐渐死亡，而芽胞却能抵抗100℃或更高一些的温度。因此，杀死芽胞要比杀死细菌的繁殖体困难得多，有的芽胞存活多年而不丧失其活力，当遇到合适条件又可生长繁殖，因此灭菌的效果应以杀死芽胞为标准。

五、细菌的生长繁殖和代谢产物

1.细菌的繁殖方式

细菌的繁殖方式是简单无性二分裂法，即一个细菌分为二个，二个分为四个，如此继续下去。球菌由于沿着一个平面或几个平面，故呈链状、葡萄状、双球菌、四联球菌、八叠球菌等状态；杆菌一般沿横轴分裂。

大部分细菌的繁殖速度很快，如大肠杆菌在适宜的条件下，每20分钟就可繁殖一代，若保持此速度繁殖10小时后，一个细菌可以繁殖10亿个。细菌繁殖虽然如此迅速，但它是受各方面因素所制约，决不能无限制地繁殖下去。

2.生长繁殖的条件

1）  水  细菌的生长繁殖是从外界吸收营养物质，通过本身含有的许多酶系统，进行一系列的生化反应分解转化成简单物质，然后加以吸收利用。水是细菌生活所不可缺水的物质。

2）碳和氮化合物、无机盐等  这些是细菌营养所必须的物质。

3）气体  氧、二氧化碳和氮与细菌的生长繁殖有密切的关系。有些细菌必须有充分的氧气供应才能生活，称为需氧菌，如结核杆菌；另一类则恰相反，要在缺氧的环境下才能生活，有氧存在反而对它们生长不利，称为厌氧菌，如破伤风杆菌；大多数但致病菌处于这两者之间，有氧无氧都生活的则称为兼性厌氧菌，如大肠杆菌。

（4）酸碱度  大多数病原菌生长适宜的酸碱度为pH7.2～7.6。

（5）温度  根据细菌对温度要求的不同，可分为嗜冷菌、嗜温菌及嗜热菌。一般病原菌的适宜温度基本与人类体温相同，因而实验室培养细菌均采用37℃。（霉菌25℃）

3.代谢产物

细菌在生长繁殖中，可产生大量的代谢产物，有的分泌到菌体外面，有的包含在菌内，有一些代谢产物对人体有益，如抗生素、维生素等；但有一些代谢产物对人体是有害的，如热原等，这些产物一旦进入机体可以致病或使体温升高。

六、外界环境中对微生物生长的影响因素

1.温度和化学因素  温度和化学因素对微生物的生长繁殖影响极大，将在物理灭菌法和化学灭菌法中讲述。

2.pH值  pH值对微生物生长的影响 ，中性繁殖很快。

3.湿度  温度可以促使细菌生长，特别对霉菌繁育更快。因此防止湿度过大对于避免染菌霉败有一定的作用。

水的活度对细菌生长的重要性，提高食品成分结合水分能力从而改变水活度。

4.渗透压  微生物的细胞具有半透膜的性质，可以透水，但对于其他物质的透过则有选择性，低渗药液可使细胞膜膨胀，但高透药液可使细胞内水分渗出而处于脱水状态。所以一般微生物在浓盐溶液或浓糖溶液中不易生长繁殖，就是由于细菌细胞内水分渗出而脱水的缘故。如蔗糖是微生物的良好营养；单糖浆含蔗糖85%，为其等渗浓度9.25%的9倍多，却能保持不长菌；若浓度不够，容易长菌败坏。

七、有关名词解释

灭菌  系指杀死或除去所有微生物的繁殖体和芽胞，使之完全无菌。

消毒  系指仅仅杀灭病原微生物，使之不成为传染源。

杀菌  系指使用化学药品或物理因素，对微生物在短时间内起杀灭的作用。

抑菌  即抑制微生物繁殖体的生长及其繁殖。

防腐  系指防止或抑制微生物生长繁殖的方法。

无菌  系指没有任何活的微生物存在。

八、物理灭菌法

（一）加热灭菌法

加热可破坏微生物中酶、蛋白质和核酸，导致微生物死亡。加热灭菌又分干热灭菌法和湿热灭菌法。在同一温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好。主要是因湿热灭菌时，有水分存在，蛋白质容易变性。水分又易使微生物膜壁润湿，湿热的穿透力比干热大。

干热灭菌法  常用的有火焰灭菌法与干热空气灭菌法两种。

（二）紫外线灭菌法

是指用紫外线照射杀灭微生物的方法。一般用于灭菌的紫外线波长是200~300nm，灭菌力很强的波长是253.7nm。紫外线作用于核酸蛋白促使其变性，同时空气受紫外线照射后产生微量臭氧，从而起共同杀菌作用。紫外线进行直线传播，可被不同的表面反射，穿透力微弱，但较易穿透清洁空气及纯净的水。因此本法适用于照射物体表面之灭菌、无菌室的空气及水的灭菌；不适用于药液的灭菌、固体物质深部的灭菌；普通玻璃可吸收紫外线，因此装于玻璃容器中的药物不能用此法灭菌。紫外线对人体照射过久，会发生结膜炎，红斑及皮肤烧灼等现象，故一般在人入室前开启紫外线灯1~2小时，关闭后人才进入洁净室。如果必须在人进去后仍要开紫外线灭菌，则人的皮肤及眼睛应有有效的防护措施。一般在6~15m3的空间可装置30瓦紫外线灯一盏，离地面2.5~3m为宜。

用紫外线照射灭菌时要注意下列问题：

1、紫外线的杀菌力，随使用时间增加而减退，一般使用时间达到额定时间70%时应更换紫外线灯管，以保证杀菌效果。国产紫外线灯平均寿命一般为2000h。

2、紫外线的杀菌作用随菌种不同而不同，杀霉菌的照射量要比杀杆菌大40~50倍。

3、紫外线照射通常按相对湿度为60%的基础设计，室内湿度增加时，照射量应相应增加。

4、紫外线灭菌效果与照射的时间长短有关，这需要通过验证来确定照射时间。

5、紫外照射灯的安装形式及高度，应根据实际情况,参考使用说明决定。

灭菌方法的验证采用生物指示剂挑战试验，生物指示剂多用枯草芽孢杆菌。

（三）微波灭菌法

微波是指频率在30~3000MHz之间的电磁波。水可强烈地吸收微波，使其极性分子转动，分子间的磨擦而生热，且升温迅速，靠热力而灭菌。在数十秒至几分钟之内可达100～150℃，并全部杀死液体中的微生物，适于水溶性注射液的灭菌。另外，固体药材饮片及固体制剂（丸剂、散剂、胶囊粉等）也含少量水分，微波能穿透到固体内部，由表至里被均匀加热，而起干燥、灭菌的作用。多用于口服液体制剂的灭菌，有望用于注射液的灭菌。但可能对某些药品的PH值、含量、颜色有影响。

（四）辐射灭菌法

辐射灭菌是应用γ射线、β射线杀灭细菌的方法，又称电离辐射，前者由钴-60或铯-137发出，穿透力强；后者由电子加速器产生，带电荷，穿透力弱，灭菌效果差。

九、化学灭菌法

化学灭菌法系指用化学药品来杀灭微生物的方法。同一种化学药品的低浓度时呈现抑菌作用，而在高浓度时则能起杀菌作用。其杀菌机理可能是：能使微生物蛋白质变性死亡，或与酶系统结合影响代谢，或改变膜壁通透性使微生物死亡等。常用的方法有消毒剂消毒法和化学气体灭菌法等。

（一）消毒剂消毒法

消毒是指杀死病原微生物的方法。但化学消毒剂大多仅能杀死微生物的繁殖体而不能杀死芽孢，能控制一定范围的无菌状态。可将消毒剂配成适宜浓度，采用喷淋、涂擦或浸泡等方法对物料、环境、器具等进行消毒。常用的化学消毒剂有0.1%～0.2%苯扎溴铵溶液、3%～5%的酚或煤酚皂溶液、75%乙醇等。常用于物体表面灭菌。但要注意其浓度不要过高，以防止化学腐蚀作用。洁净室的墙面、天花板、门窗、机器设备、仪器、操作台、车、桌、椅等表面以及人体双手（手套）在环境验证及日常生产时，应定期清洁并用消毒剂喷洒，无菌室用的消毒剂必须在层流工作台中，用0.22μm的滤膜过滤后方能使用。

（二）化学气体灭菌法

系指利用化学药品的气体或产生的蒸汽进行杀灭微生物的方法。

1.环氧乙烷灭菌法 

环氧乙烷灭菌法是利用环氧乙烷气体进行杀菌的方法。它是一种传统的灭菌方法，可应用于工衣灭菌、不耐加热灭菌的药品、医用器具、设施、设备等的灭菌。

环氧乙烷灭菌系统，主要有下列四项互相制约的重要因素影响灭菌效果：

1、温度；2、湿度；3、气体浓度；4、灭菌时间。

因为环氧乙烷是易燃易爆物质，明火可以引起燃烧，同时由于气体分解还可能引起爆炸，环氧乙烷灭菌中应十分注意安全问题。

2.甲醛等蒸汽熏蒸法 

采用甲醛、丙二醇或过氧醋酸等化学品，通过加热产生蒸汽进行空气环境灭菌。

(1)、计算房间体积，按10g/m3的比例称出甲醛。

(2)、将甲醛倒入甲醛发生器或加热盘或烧杯中，并放好加湿用水，必要时还需加入高锰酸钾（2~3g/m3），然后加热（甲醛发生器用蒸汽加热，加热盘或烧杯用热水盛入其中加热）使其蒸发成气体。

(3)、灭菌流程：空调器停止运转→启动甲醛气体发生器或在加热盘中加热甲醛  →让甲醛气体扩散约30分钟→启动空调器让甲醛气体循环约30分钟→停止空调器，房间熏蒸消毒，时间不少于8小时→ 房间排气，用新鲜空气置换约2小时→ 恢复正常运行。

当相对湿度在65%以上，温度在24~40℃时，甲醛气体的消毒效果很好。

3、臭氧消毒法

臭氧（O3）的消毒原理是：臭氧在常温、常压下分子结构不稳定，很快自行分解成氧（O2）和单个氧原子（O），后者具有很强的活性，对细菌有极强的氧化作用，臭氧氧化分解了细菌内部氧化葡萄糖所必须的酶，从而破坏其细胞膜，将其杀死。多余的氧原子则会自行重新结合成为普遍氧分子（O2），不存在任何有害残留物，故称为无污染消毒剂。它不但对种种细菌（包括肝炎病毒、大肠杆菌、绿脓杆菌及杂菌等）有极强的杀灭能力，而且对霉菌也很有效。

十、无菌操作法

无菌操作室应达到GMP的规定，为达无菌的要求可采取综合措施：

①应采用层流洁净空气技术；

②可采用甲醛等蒸汽熏蒸法消毒和紫外灯灭菌法进行空气环境灭菌；

③室内用具、墙、桌等暴露面用消毒剂喷、擦消毒；

④其他物品可热压或干热法灭菌；

⑤操作人员衣、帽、鞋、手等消毒及灭菌。

无菌操作室应定期进行菌落检查。一般采用培养皿暴露20~30min，37℃培养48h，每只培养皿内不超过3个菌落为合格。

十一、食品的防腐与防腐剂

微生物有水分及其他适宜条件就可以繁殖，很多食品易被微生物污染，所以除采用适当方式灭菌外，可加防腐剂以抑、杀微生物。

防腐剂，又称抑菌剂，系指能抑制微生物生长繁殖的物质，常用的防腐剂有：

1.苯甲酸与苯甲酸钠  为常用的有效防腐剂，一般用量为0.1%～.25%。苯甲酸水溶性较差，而苯甲酸钠水溶性好，易溶解，应用方便。

2.对羟基苯甲酸酯（尼泊金类）  有甲、乙、丙、丁四种酯，抑霉菌作用较强，一般用量为0.01%～0.25%。

3.山梨酸与山梨酸钾  山梨酸的分子结构式为CH3—CH=CH—CH=CH—COOH，常用浓度为0.15%～0.05%。对细菌和霉菌均有较强抑菌效力。

 4.其他  含20%以上乙醇、含30%以上的甘油、中药中很多挥发油及0.1脱水醋酸等均有防腐效力。
                           华科仪器水分活度仪将持续为防霉保鲜提供帮助